液相色谱仪分析方法开发你学会了吗,一文带你了解【全网解说】-凯时kb88官方

凯时kb88官方-凯时app官方首页分析方法开发你学会了吗？液相色谱仪是一种实验室内用来分析数据的一种仪器，是一种高效且准确的分析方法，而分析方法在不同的行业中就有不同的要求，部分行业对质量控制有很高的要求，液相色谱仪分析方法是质量控制的重要手段，那么液相色谱仪分析方法开发你学会了吗？接下来和天恒仪器小编一起了解一下吧。

液相色谱主要有亲水色谱、正相色谱、反相色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱/体积排阻色谱等几种色谱分离模式。其中反相色谱是到目前为止*通用的 hplc 方法，大约占所有方法的 60%，将近 95% 的色谱工作者都在使用。那么本文我们主要来讲反相色谱分析方法的开发。

反相色谱的原理：分析物与疏水固定相之间发生非极性、非特异性相互作用，即分析物在极性流动相和非极性固定相之间分配，与正相色谱相反。反相色谱柱通常使用的固定相有c18、c8苯基。反相色谱系统通常使用的流动相有:a. 水，可含缓冲液，或用酸或碱调节ph ， b . 可与水混溶的有机溶剂。

如何来开发一个合理可行的反相色谱分析方法，这其实是每一个色谱工作者必须面对并解决的问题。分析方法的开发其实主要是选择合适的色谱柱、流动相、检测波长来得到一个初步分析方法，后面再做其他方面的优化，使色谱峰之间的分离度、峰形、峰高、峰宽满足要求。下面我们就来仔细讲讲反相色谱分析方法的开发。

一、色谱柱的选择：

高效液相色谱分析中，色谱柱的选择直接影响了分离效果的好坏，选择合适的色谱柱可以缩短方法开发所需的时间，并且使方法更具稳定性。但是我们要清楚现在商品化的液相色谱柱比比皆是，根据色谱柱的参数可以给我们提供一个初步的选择，但由于各个仪器厂商的填料技术和键合技术都有差异。即使都是c18柱，不同品牌、同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低ph值的、有耐高温的、有适合碱性样品的等等。那就要求我们要对各种类型的色谱柱做充分的了解之后，才能做出合适的选择。

二、流动相的选择

一般来说，反相lc 的流动相包括水和作为改性剂的乙腈或甲醇。改性剂还有四氢呋喃（thf）和异丙醇。反相色谱中流动相中水相的ph和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随 ph 改变而明显变化。在这类反相系统中，控制 ph 对于保留和选择性的稳定非常重要。通常在 ph 2 到 4 条件下，保留时间对ph的微小改变稳定性*高，因此色谱工作者将这一ph范围作为大多数样品方法开发的起始ph，包括碱性化合物和一般的弱酸。

为了有较好的重现性，所用的 ph 应高于或低于待分离溶质pka或pkb上下一个ph单位。如果不清楚分析物的pka，建议大家测试一种以上流动相 ph 可提供*好结果。大多数反相柱都可以在ph 2-8条件下使用，这样为分离选择*佳流动相 ph 提供了较宽的范围。流动相 ph 对色谱分离的影响有多种方式。根据所分析的化合物，ph可能影响选择性、峰形和保留。如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随 ph的改变变化非常明显，如果是非极性较强或中性的化合物，ph 对分离度和保留的影响一般不明显。

三、波长的选择

做分析方法开发我们需要二极管阵列检测器，选择检测波长和做色谱峰纯度检查，通过色谱 峰纯度检查来保证主峰里没有掩盖其它杂质，做纯度检测对波长选择的要求比较简单，原则 是把尽量多的杂质在色谱图上体现出来。很多杂质只有在低波长下才有紫外吸收，所以我们 选择尽可能低的波长，乙腈的截止波长在 190~195nm，用乙腈做流动相检测波长可以选择 在 210~220nm。也有公司要求分别选取产品紫外吸收*强的波段和 210~220nm 两个波段做 对比，哪个纯度低以哪个为准，这样可以更严格的控制产品的质量。

四、分析方法的优化

01

改变梯度斜率

更缓的梯度斜率可以提高分离度，降低梯度斜率将降低灵敏度， 更陡的梯度斜率可能压缩色谱峰，经常会导致分离度的降低， 增加梯度斜率将增加灵敏度， 改变梯度斜率时要平衡峰高与分离度的关系。

02

改变柱温

温度会影响色谱分析中的每一个化学过程，例如增加温度会降低移动相的粘度，如果流动速度恒定将导致系统背压降低，高温将改变固定相和流动相之间的分配速率，然而由于提高了被测物分散性，会加快优化线性速度。对温度变化敏感的化合物，温度的微小变化都会导致选择性发生独特变化。在这里我们要注意选择柱温一要考虑色谱柱的承受范围，二要考虑该温度下，检测成分是否会降解。

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